Testing of patient-derived stem cell extracellular vesicles loaded with drugs in a personalized lung-cancer on-chip platform (LoC4Ev)

Project Title: Testing of patient-derived stem cell extracellular vesicles loaded with drugs in a personalized lung-cancer on-chip platform (LoC4Ev).”

Funding: European Regional Development Fund (ERDF), Measure “Support for applied research”

Project No.:

Period: 1 February 2021 – 30 November 2023

Project costs: 540 540.53 EUR

Principle Investigator: Dr. biol. Artūrs Ābols

Cooperation partner: SIA “Cellboxlab”

Project Summary

This project aims to develop a personalised NSCLC patient lung cancer on chip (LCoC) and lung on chip (LoC) as a model system where to test the efficacy of drug-loaded patient-derived MSC produced EVs compared to the drug by itself.

Over half of the people diagnosed with lung cancer die within a year of diagnosis and the 5-year survival rate is less than 18%. Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for the majority of all lung cancer cases. Depending on the stage of lung cancer, patients are eligible for certain treatments ranging from surgery to radiation to chemotherapy as well as targeted therapy. Thanks to genetic screening, specific mutations have been identified as a better target treatment for individual patients in the last decade. Also, there are molecular targeted therapies, that are not yet tested in lung cancer but could be applied in NSCLC cases where tumours have certain genetic variation. While there are options for different treatment, there is still a room for improvements in drug delivery, that could increase specificity and therefore decrease necessary concentrations and subsequently side effects of drugs. Extracellular vesicles (EV) have a natural ability to carry functional biomolecules, such as RNA, DNA, proteins and different metabolites in their lumen. This property makes EVs attractive for use in drug delivery. Indeed, several studies are currently underway to develop methods of exploiting EV for use as efficient drug delivery vehicles especially those derived from mesenchymal stem cells (MSC) due to their natural tumour cell tropism. However, current approaches have been tested only in simple in-vitro models or animal models. Next step would be testing these approaches into more advanced – personalised in vitro systems such as organs on chip platform

Published on 01.02.2021

Progress of the Project

1 February 2021 – 30 April 2021

This reporting period, we started to prepare CMEK permit application for patient sample collection. Agreed on protocols for patient sample collection with doctors. Planning of the protocols for the isolation of lung cancer cells and the formation of organoids from patient surgery samples and the isolation of normal fibroblasts and their reprogramming into induced pluripotent stem cells (iPSC). Protocols for iPSC differentiation into lung epithelium, endothelium, and induced mesenchymal stem cells are also being developed. Lists of reagents for the necessary experiments are compiled. In parallel, the introduction of stem cell-derived extracellular vesicles (ASC52telo) into the first lung cancer on chip (LCOC) prototypes developed using stable cell lines A549 and HUVEC are being tested.

Information published 30.04.2021

1 May 2021 – 31 July 2021

This reporting period we have been working on the TEER electrode design in a computer-aided design suit. Furthermore, we have been evaluating literature on the most optimal thin film electrode thickness and subsequently have been done the initial tests of electrode deposition via thermal evaporation. Additionally, five LOC devices have been fabricated for ensuing biological testing. Next, developed devices were tested with extracellular matrix (ECM) treatment process, functionalisation with HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells), HSAEC (Human small airway epithelial cells) and pre-ECM treatment, cell seeding protocol was optimised to get functional models. Next LOC models are cultivated for functional LOC model tests with biosensors and ALI (Air liquid interface) establishment.

Information published 01.08.2021

1 August 2021 – 31 October 2021

This reporting period we have been working on the fabrication of the first version of lung on chip (LOC) devices made from Off-stoichiometry thiol-ene polymer (OSTE) and thermoplastics with thin-film TEER (trans epithelial electric resistance) electrodes. Optimisation of the interconnection between thin-film electrodes and spring-loaded connectors. We are currently testing interconnections made from silver-loaded epoxy that sets in low temperature (60C). Low-temperature reflow soldering paste (138C) is also being tested with the heat applied to the spring-loaded connectors, which are immersed into the paste. Next, we have started to test commercial hiPSC (human induced pluripotent stem cells) differentiation into endothelial cell protocols with STEMCELL Technologies reagents, that will be applied to personalise Loc4Ev devices. LOC devices with integrated TEER biosensor were functionalised with HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells) and A549 cells to test TEER functionality. Lecture about organs on a chip including LOC was prepared and presented to the M.D. students.

Information published 30.10.2021.

1 November 2021 – 31 January 2022

During this reporting period, we worked on the integration of O2 biosensors into LOC developed from Off-stoichiometry thiol-ene polymer (OSTE) and thermoplastics. The sensors were tested in both fluids such as 1xPBS and cell culture medium and in gas mixtures in cell culture incubators under normoxia and hypoxia. The commercial hiPSC (human-induced pluripotent stem cell) differentiation protocol into endothelial cells with STEMCELL Technologies reagents was optimised, that will be used to personalize Loc4Ev devices. Currently we are working to optimize the cisplatin packaging into mesenchymal stem cell derived extracellular vesicles methodology.

Information published 31.01.2022

1 February 2022 - 30 April 2022

Throughout the reporting period we haveoptimised the design of the device to improve the OSTED filling in thesidewalls of the device, which has led to improved fabrication yield of TEERdevices. An alternative material to the mold material has been selected, whichhas significantly reduced particle contamination onto the thin-film TEERelectrodes, therefore the resistance variation from channel to channel is now<10% for the current protocol, tested across multiple devices. Furthermore,an improved device design has allowed incorporation of 3 oxygen measurement portsper chip as opposed to initial design of 2 ports per chip. Experiments with theoxygen sensing in the chips are now being biologically validated. Workhas been completed on optimizing cisplatin packaging in mesenchymal stem cellsecreted extracellular vesicles. In parallel, testing of cisplatin-filledextracellular vesicles in lung cancer on a chip and lung on chip made up ofcommercial primary cells and stable cell lines was initiated. Results arecompared between EVs without cisplatin and cisplatin without EVs. In addition,during this period we participated in the publication of the project topic inan online interview organized by the Riga Technical University Student Councilin the studio entitled "What if?".

Information published 29.04.2022

1 May 2022 - 31 July 2022

TEER containing devices were tested by growing commercialprimary and stable cell lines during lung on chip and lung cancer on chipestablishment and during establishing ALI. Oxygen sensor placement outside thedevice within custom jig has been designed. HPLC methodology has been optimisedto measure cisplatin within EVs. Next, EV staining by SYTOX and uptakeexperiments have been also optimised. In addition, during this period weparticipated and presented research project topics within conversation festivalLAMPA at Cēsis, Latvia to the general public.

Information published 31.07.2022

1 August 2022 – 31 October 2022

During this report period several NSCLC patient tissue, urine and blood samples were collected, NSCLC organoids were developed and normal fibroblasts isolated from operation samples. Additionally, somatic cells from urine samples and PBMC from blood samples were collected. Cisplatin containing and empty extracellular vesicles as a control were produced by using MSC cells. Extracellular vesicles were quantified and characterised.

Throughout the period, continued experimental work on TEER electrode setup was done. A source of signal noise was identified and significantly reduced through a novel experimental setup. An alternative O2 measurement has been designed and currently is prototyped, which would allow to measure O2 levels without additions of oxygen port.

Results of the project were presented at two international conferences with oral presentations as an invited speaker. Additionally, short video was made and published about organ on a chip technology developed by LBMC and CellboxLabs in popular scientific language in “Aculiecinieks”.

Information published 31.10.2022

1 November 2022 - 31 January 2023

During this report period several additional NSCLC patienttissue, urine and blood samples were collected, NSCLC organoids were developedand normal fibroblasts isolated from operation samples. Additionally, somaticcells from urine samples and PBMC from blood samples were collected. Cisplatinmeasurement method was established to quantify it in EVs. Additionallynormal fibroblast reprogramming into iPSC was started.
Throughout the period, work on chip design optimization and fabricationprotocol was done, in order to increase the channel yield. Further TEERmeasurement setup was optimized to ensure consistent conditions during TEERmeasurements. Experiments and design process with a novel O2 measurement setupis on-going.  .
Results of the project were presented at international conference with posterpresentation. Additionally, project authors participated in a radiointerview:  "Zināmais nezināmajā" - Pirmsklīniskie pētījumi -orgāni uz čipa un laboratoriju peles

Information published 31.01.2023

Zāļu pakošana pacientu cilmes šūnu sekretētās vezikulās un testēšana personalizētā plaušu vēža uz čipa platformā

Projekta nosaukums: „Zāļu pakošana pacientu cilmes šūnu sekretētās vezikulās un testēšana personalizētā plaušu vēža uz čipa platformā”

Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) pasākuma “Praktiskas ievirzes pētījumi” 4. kārtas ietvaros.

Projekta identifikācijas Nr.:

Projekta izpildes termiņš: 2021. gada 1. februāris – 2023. gada 30. novembris

Projekta kopējais finansējums: 540 540.53 EUR

Projekta zinātniskā vadītāja: Dr. biol. Artūrs Ābols

Sadarbības partneris: SIA “Cellboxlab”

Projekta kopsavilkums

Projekta mērķis ir izstrādāt personalizētu NSCLC pacienta plaušu vēzi uz čipa (LCoC) un plaušu uz čipa (LoC) kā modeļa sistēmu, kur pārbaudīt pacienta MSC izdalīto ar zālēm piepildīto EV efektivitāti, salīdzinot ar zālēm bez EV.

Atkarībā no plaušu vēža stadijas, pacienti var saņemt dažādu veidu ārstēšanu, sākot no operācijas līdz staru terapijai un ķīmijterapijai, kā arī mērķa terapijai. Pateicoties ģenētiskajam skrīningam, pēdējās desmitgades laikā ir noteiktas vairākas specifiskas mutāciju vietas, uzlabojot mērķa terapijas efektivitāti individuāliem pacientiem. Pastāv arī molekulāri mērķētas terapijas, kuras vēl nav pārbaudītas plaušu vēža gadījumā, bet kuras varētu piemērot NSCLC gadījumos, kad audzējiem ir noteiktas ģenētiskas variācijas. Kaut arī pastāv dažādas ārstēšanas iespējas, joprojām ir iespējami uzlabojumi zāļu piegādē, kas varētu palielināt to specifiskumu un tādējādi samazināt nepieciešamo zāļu koncentrāciju un līdz ar to samazināt zāļu izraisītas blakusparādības. Ārpusšūnu vezikulām (EV) piemīt spēja pārnēsāt funkcionālās biomolekulas, piemēram, RNS, DNS, proteīnus un dažādus metabolītus savā lūmenā. Šī īpašība padara EV kā labas kandidātes zāļu piegādes lietošanai. Šobrīd, vairāki jauni pētījumi tiek veikti tieši, lai uzlabotu metodes, ar kādām EV varētu tikt izstrādātas, lai tās varētu izmantot par efektīvām zāļu transportēšanas līdzekļiem. Īpaša uzmanība tiek pievērsta EV, kas iegūtas no mezenhimālajām cilmes šūnām (MSC) to dabiskā audzēja šūnu tropisma dēļ. Tomēr pašreizējās metodes, lai sasniegtu šo mērķi līdz šim šī pieeja, ir pārbaudīta tikai vienkāršos in vitro modeļos vai dzīvnieku modeļos. Kā nākamais solis, būtu šo metožu testēšana uzlabotās un vairāk personalizētās in vitro sistēmās, piemēram, orgānu uz čipa platfromā

Publicēts 01.02.2021

Projekta progress

2021. gada 1. februāris – 2021. gada 30. aprīlis

Pārskata periodā ir uzsākts sagatavot CMĒK atļaujas pieteikums pacienta parauga ievākšanai un saskaņoti protokoli pacienta parauga ievākšanai ar ārstiem. Tiek veikts intensīvs darbs ar literatūru, lai saplānotu protokolus plauša vēža šūnu izdalīšanai un organoīdu izveidošanai no pacientu operācijas materiāla, normālu fibroblastu izdalīšanai un to pārprogrammēšanai inducētās pluripotentās cilmes šūnās (iPSC). Kā arī tiek sastādīti protokoli iPSC diferencēšanai uz plaušu epitēlija, endotēlija un inducēto mezenhimālo cilmes šūnām. Tiek sastādīti reaģentu saraksti nepieciešamiem eksperimentiem. Paralēli tiek testēst no cilmes šūnām iegūtas ārpus šūnu vezikulu (ASC52telo) uznešana uz pirmiem plaušu vēzis uz čipa (LCOC) prototipiem, kas izveidoti izmantojot stabilas šūnu līnijas A549 un HUVEC.

Informācija publicēta 30.04.2021.

2021. gada 1. maijs – 2021. gada 31. jūlijs

Šajā pārskata periodā mēs strādājām pie TEER elektrodu dizaina CAD lietotnē. Papildus šim, mēs esam veikuši literatūras apskatu par optimālāko plānās kārtiņas elektrodu biezumu un pēc tam esam veikuši sākotnējos elektrodu nogulsnēšanās testus, izmantojot termisko iztvaikošanu. Turklāt sekojošām bioloģiskām pārbaudēm ir izgatavotas piecas LOC ierīces. Pēc tam izstrādātās ierīces tika pārbaudītas ar ārpusšūnu matricas (ECM) apstrādes procesu, funkcionalizāciju ar HUVEC (cilvēka nabas vēnu endotēlija šūnām), HSAEC (cilvēka mazo elpceļu epitēlija šūnas). Rezultātā ECM apstrādes, šūnu sēšanas protokols tika optimizēts, lai iegūtu funkcionālus modeļus. Nākamie LOC modeļi tiek audzēti funkcionāliem LOC modeļa testiem ar biosensoriem un ALI (Air liquid interface) izveidei.

Informācija publicēta 01.08.2021.

2021. gada 1. augusts – 2021. gada 31. oktobris

Šajā pārskata periodā mēs strādājām pie pirmās plaušas uz čipa (LOC) iekārtas versijas, kas izgatavotas no Off-stoichiometry thiol-ene polymer (OSTE) un termoplastikas ar plānslāņa TEER (trans epitēlija elektriskās pretestības) elektrodiem. Veicām plānās kārtiņas elektrodu un savstarpējo savienojumu optimizācijas. Pašlaik mēs pārbaudām starpsavienojumus, kas izgatavoti no epoksīda ar sudrabu, kas sacietē zemā temperatūrā (60C). Zemas temperatūras lodēšanas pasta (138C) tiek pārbaudīta arī ar siltumu, kas ir piemērots TEER savienojumiem. Esam uzsākuši pārbaudīt komerciālo hiPSC (cilvēka inducētās pluripotentās cilmes šūnas) diferenciāciju protokolus par endotēlija šūnām  ar STEMCELL Technologies reaģentiem, kas tiks izmantoti Loc4Ev ierīču personalizēšanai. LOC ierīces ar integrētu TEER biosensoru tika funkcionalizētas ar HUVEC (cilvēka nabas vēnas endotēlija šūnām) un A549 šūnām, lai pārbaudītu TEER funkcionalitāti. Tika sagatavota lekcija medicīnas doktorantūras studentiem par orgāniem uz čipa, tostarp LOC.

Informācija publicēta 30.10.2021.

2021. gada 1. novembris – 2022. gada 31. janvāris

Šajā pārskata periodā mēs strādājām O2 biosensoru integrēšanas plaušas uz čipa iekārtās izgatavotās no Off-stoichiometry thiol-ene polimēra (OSTE) un termoplastikas. Sensori tika testēti gan šķidrumos, tādos kā 1xPBS un šūnu barotne, gan gāzu maisījumos, kas atrodas šūnu kultivēšanas inkubatoros normoksijas un hipoksijas apstākļos. Ir optimizēts komerciālo hiPSC (cilvēka inducētās pluripotentās cilmes šūnas) diferenciācijas protokols par endotēlija šūnām ar STEMCELL Technologies reaģentiem, kas tiks izmantoti Loc4Ev ierīču personalizēšanai. Šobrīd notiek darbs pie cisplatīna pakošanas mezenhimālo cilmes šūnu sekretēto ārpusšūnu vezikulās metodoloģijas optimizēšanas.

Informācija publicēta 31.01.2022.

2022. gada 1. februāris– 2022. gada 30. aprīlis

Visā pārskata periodā esam optimizējuši ierīces dizainu, lai uzlabotu OSTE aizpildījumu ierīces sānu sienās, kā rezultātā ir uzlabojusies TEER ierīču ražošanas ražība. Veidnēm ir izvēlēts alternatīvs materiāls, kas ir ievērojami samazinājis daļiņu piesārņojumu uz plānās kārtiņas TEER elektrodiem, tāpēc pretestības variācijas no kanāla uz kanālu tagad ir <10% pašreizējam protokolam, kas pārbaudīts vairākās ierīcēs. Turklāt uzlabotais ierīces dizains ir ļāvis iekļaut 3 skābekļa mērīšanas portus vienā čipā pretstatā sākotnējam dizainam ar 2 portiem katrā čipā. Eksperimenti ar skābekļa sensoru čipos tagad tiek bioloģiski apstiprināti. Ir pabeigts darbs pie cisplatīna pakošanas mezenhimālo cilmes šūnu sekretēto ārpusšūnu vezikulās metodoloģijas optimizēšanas. Paralēli tika uzsākts ar cisplatīnu pildīto arpus šūnu vezikulu testēšana uz plaušu vēzis uz čipa un plaušas uz čipa, kas izveidots no komericālām pirmārām šūnām un stabilām šūnu līnijām, salīdzinājumā ar EVs bez cisplatīna un cisplatīnu bez EVs. Papildus šajā laika posmā mēs iesaistījāmies projekta tēmas publicēšanā Rīgas Tehniskās Universitātes studentu padomes organizētajā tiešsaistes intervijā Spiikiizi studijā ar nosaukumu “Kā būtu, ja?”.

Informācija publicēta 29.04.2022.

2022. gada 1. maijs – 2022. gada 31. jūlijs

TEER saturošās ierīces tika pārbaudītas, audzējotkomerciālās primārās un stabilās šūnu līnijas plaušas uz čipa un plaušu vēzisuz čipa izveidošanas laikā, kā arī ALI izveidošanas laikā. Ir izstrādātsskābekļa sensora novietojums ārpus ierīces dizains. Ir optimizēta HPLCmetodoloģija, lai mērītu cisplatīnu EVs. Kā arī ir izstrādāta EV krāsošana arSYTOX EV uzņemšanas eksperimentiem. Turklāt šajā periodā piedalījāmies unplašākai sabiedrībai prezentējām pētniecības projekta tēmas sarunu festivālāLAMPA Cēsīs, Latvijā.

Informācija publicēta 31.07.2022.

  1. gada 1.augusts - 2022. gada 31.oktobris

Šajā pārskata periodā tika savākti vairāki NSCLC pacienta audu, urīna un asins paraugi, izveidoti NSCLC organoīdi un no operācijas paraugiem izolēti normāli fibroblasti. Turklāt tika savāktas somatiskās šūnas no urīna paraugiem un PBMC no asins paraugiem. Tika saražotas cisplatīnu saturošas un tukšas ekstracelulārās vezikulas kā kontrole, izmantojot MSC šūnas. Ekstracelulārās vezikulas tika kvantificētas un raksturotas.

Šajā periodā tika veikts eksperimentālais darbs pie TEER elektrodu integrācijas. TEER signāla trokšņa avots tika identificēts un ievērojami samazināts, izmantojot jaunu eksperimentālu iestatījumu. Ir izstrādāts un šobrīd tiek prototipēts alternatīvs O2 mērījumu uzstādījums, kas ļautu izmērīt O2 līmeni bez skābekļa pievada pievienošanas čipos. Projekta autori tika uzaicināti prezentēt projekta rezultātus divās starptautiskās konferencēs ar mutiskām prezentācijām. Papildus tika izveidots un “Aculieciniekā” publicēts īss video par LBMC un CellboxLabs izstrādāto orgāni uz čipa tehnoloģiju

Informācija publicēta 31.10.2022.

2022. gada 1. novembris – 2023. gada 31.janvāris

Šajā pārskata periodā tika savākti vairāki papildus NSCLCpacienta audu, urīna un asins paraugi, tika izveidoti NSCLC organoīdi un nooperācijas paraugiem izolēti normāli fibroblasti. Turklāt tika savāktassomatiskās šūnas no urīna paraugiem un PBMC no asins paraugiem. Tika izstrādātaCisplatīna kvantificēšanas metode vezikulās. Turklāt tika uzsākta normālafibroblastu pārprogrammēšana uz iPSC.
Laika posmā tika veikts darbs pie TEER čipu dizaina optimizācijas unizgatavošanas protokola, lai palielinātu kanālu ražīgumu. Turpmāka TEERmērījumu iestatīšana tika optimizēta, lai nodrošinātu konsekventus apstākļusTEER mērījumu laikā. Eksperimenti un projektēšanas process ar jaunu O2 mērījumuiestatījumu turpinās
Projekta rezultāti tika prezentēti ar postera starptautiskā konferencē.Papildus projekta autori piedalījās radio intervijā: "Zināmaisnezināmajā" - Pirms klīniskie pētījumi - orgāni uz čipa un laboratorijupeles.

Informācija publicēta 31.01.2023.

Cellbox Labs gut on chip
Cellbox Labs gut on chip

Get in touch